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      假陽(yáng)(yáng)性?條帶不對?菌液PCR問(wèn)(wèn)題一網(wǎng)(wǎng)打盡

      發(fā)(fā)布時(shí)(shí)間: 2024-06-13  點(diǎn)(diǎn)擊次數: 88次

      1.平板長(cháng)(cháng)菌,但挑的單克隆菌落搖不起來(lái)(lái)?

      產(chǎn)(chǎn)生原因及解決辦法:

      (1)挑取的單克隆為雜菌,呈假陽(yáng)(yáng)性。出現這種情況的原因包括:①配制平板過(guò)(guò)程中,加入抗生素時(shí)(shí)溫度過(guò)(guò)高致使抗生素滅活;②配制平板過(guò)(guò)程中,抗生素濃度過(guò)(guò)低;③平板培養時(shí)(shí)間太長(cháng)(cháng)導致抗生素失效。


      (2)液體培養基的抗生素使用錯誤。


      (3)液體培養基抗生素濃度過(guò)(guò)高,導致大腸桿菌生長(cháng)(cháng)緩慢。


      (4)菌液保存太久,導致菌的活力過(guò)(guò)低。辦法:重新劃線(xiàn)(xiàn)涂板,挑取單克隆。


      (5)自己制備的感受態(tài)(tài)細胞受到雜菌污染。


      (6)噬菌體污染?,F象描述:菌液清亮或渾濁后變?yōu)榍辶?,底部有沉淀。辦法:甲醛熏蒸超凈臺,對整個(gè)(gè)實(shí)(shí)驗環(huán)(huán)境進(jìn)(jìn)行消毒;重新提質(zhì)(zhì)粒,重新轉化。


      2. 平板長(cháng)(cháng)菌,挑的單克隆菌落能搖起來(lái)(lái),但菌液PCR沒(méi)(méi)有條帶?

      產(chǎn)(chǎn)生原因及解決辦法:

      (1)重組或連接失敗。出現這種情況的原因包括:①質(zhì)(zhì)粒沒(méi)(méi)有切開(kāi)(kāi);②質(zhì)(zhì)粒切開(kāi)(kāi)后自連。

      (2)搖菌時(shí)(shí)間過(guò)(guò)長(cháng)(cháng),菌液濃度過(guò)(guò)大。辦法:搖菌不超過(guò)(guò)6小時(shí)(shí),4-5小時(shí)(shí)即可。

      (3)PCR反應體的原因。出現這種情況的原因包括:①酶;②引物。辦法: 換酶,使用熱啟動(dòng)(dòng)酶;使用載體通用引物。

      3. 平板長(cháng)(cháng)菌,挑的單克隆菌落能搖起來(lái)(lái),但菌液PCR與陽(yáng)(yáng)性對照的大小不對?

      產(chǎn)(chǎn)生原因及解決辦法:

      (1)引物特異性差,導致擴增到大腸桿菌的基因。辦法:使用載體的通用引物。

      (2)目的基因存在所用酶的酶切位點(diǎn)(diǎn),酶切位點(diǎn)(diǎn)切錯,僅部分連接,導致片段變小。

      (3)小片段核酸污染。這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性??苫ハ嗥唇?,與引物互補后擴增出條帶。

      (4)瓊脂糖凝膠電泳會(huì )(huì )產(chǎn)(chǎn)生偏差,相差一點(diǎn)(diǎn)極有可能是目的條帶。辦法:送測序進(jìn)(jìn)行驗證。

      4. 平板長(cháng)(cháng)菌,挑的單克隆菌落能搖起來(lái)(lái),但菌液PCR出現多條條帶?

      產(chǎn)(chǎn)生原因及解決辦法:

      (1)引物特異性差,導致擴增到大腸桿菌的基因。辦法:使用載體的通用引物。

      (2)Mg2+離子濃度過(guò)(guò)高、退火溫度過(guò)(guò)低,PCR循環(huán)(huán)次數過(guò)(guò)多。

      (3)酶量過(guò)(guò)多或酶的質(zhì)(zhì)量差。

      (4)菌落污染。

      5. 平板長(cháng)(cháng)菌,挑的單克隆菌落能搖起來(lái)(lái),菌液PCR也有目的條帶,但測序無(wú)(wú)信號?

      產(chǎn)(chǎn)生原因及解決辦法:

      (1)未連接到載體的目的片段仍存在在菌液里,單克隆的菌落為原始質(zhì)(zhì)粒,菌液PCR有條帶。

      (2)污染。出現這種情況的原因包括:①菌液污染。②酶,引物,Buffer等污染。③氣溶膠污染。

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