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      提高效率與質(zhì)(zhì)量的實(shí)(shí)用技巧

      發(fā)(fā)布時(shí)(shí)間: 2024-06-12  點(diǎn)(diǎn)擊次數: 66次

      1、提高實(shí)(shí)驗的效率

      1)實(shí)(shí)驗前有計劃安排、預備方案或者“車(chē)(chē)輪戰"(細胞實(shí)(shí)驗)

      一般從基礎的培養細胞開(kāi)(kāi)始,開(kāi)(kāi)始實(shí)(shí)驗時(shí)(shí),實(shí)(shí)驗方法一般來(lái)(lái)自于實(shí)(shí)驗室或者文獻中條件優(yōu)(yōu)化以及自我推測及驗證,因此做實(shí)(shí)驗之前預想實(shí)(shí)驗方案有助于我們不至于“手忙腳亂"。


      以實(shí)(shí)驗前的細胞鋪板實(shí)(shí)驗為例:

      表1 常用細胞培養體系:

      提高效率與質(zhì)(zhì)量的實(shí)(shí)用技巧

      細胞鋪板的孔數一般取決于我們后期實(shí)(shí)驗的目的,實(shí)(shí)驗前了解各類(lèi)(lèi)細胞的鋪板數量以及培養基添加量都十分重要。以病毒或者細菌感染細胞模型來(lái)(lái)說(shuō)(shuō),我們需要一個(gè)(gè)比較準確數量級的細胞數目和病毒或菌液濃度得后期實(shí)(shí)驗的MOI值,細胞計數和病毒及菌液濃度測定也很關(guān)(guān)鍵;


      細胞鋪板:我們需要收集盡可能多的細胞,原因是當我們剩余出來(lái)(lái)的細胞可用于細胞傳代繼續保留,可若是鋪板數量達不到(重新離心收集細胞浪費時(shí)(shí)間)可能會(huì )(huì )導致加藥濃度過(guò)(guò)大使得細胞大量死亡而影響后期實(shí)(shí)驗,比如你要提取RNA或者蛋白,細胞數目不足,后期的RNA濃度或者BCA測蛋白濃度的結果都不是非常理想繼而影響后面實(shí)(shí)驗的進(jìn)(jìn)展。


      2)具體安排(Western blot實(shí)(shí)驗)

      從試驗干擾開(kāi)(kāi)始(給藥處理),根據實(shí)(shí)驗步驟來(lái)(lái)講,完整的Western blot實(shí)(shí)驗預計2-3天。

      (1)以給藥時(shí)(shí)間24h為例:24h后,收集細胞提取蛋白,貼壁細胞加IP裂解液或RIPA裂解液用細胞刮板移至1.5ml離心管;懸浮細胞收集細胞至離心管離心去除培養基,用PBS清洗離心去除上清再加入裂解液,預計提取蛋白以及BCA測蛋白濃度一上午的時(shí)(shí)間,估計上樣體積加入loading buffer煮蛋白置于-80℃保存;下午跑蛋白電泳,SDS-PAGE膠可于前一天晚上制好防止-4℃冰箱保存(用少量純水用封裝袋保存)或使用預制膠,大概1多小時(shí)(shí)蛋白maker跑到距離膠最下面1-2cm處停止電泳;轉模,根據目的蛋白的大小確定轉膜時(shí)(shí)間和毫安數,結束后裁膜用5%脫脂奶粉封閉,之后孵育一抗4℃過(guò)(guò)夜,第二天洗膜孵育二抗并進(jìn)(jìn)行顯影,因此步驟時(shí)(shí)間熟練的話(huà)(huà)2天就可以完成一次WB實(shí)(shí)驗。

      (2)預備方案:實(shí)(shí)驗重復是不可避免的,因此預備下一周期實(shí)(shí)驗方案(車(chē)(chē)輪戰)有助于縮短時(shí)(shí)間提高效率,當然,師兄師姐以及廣大學(xué)(xué)術(shù)(shù)里的經(jīng)(jīng)驗小tips也有助于提高實(shí)(shí)驗效率。例如,在WB配制SDS-PAGE膠的凝固時(shí)(shí)間通常會(huì )(huì )隨季節溫度的變化而改變,夏季和冬季應該時(shí)(shí)間就會(huì )(huì )產(chǎn)(chǎn)生差異(冬季凝固較慢),再者,AP 和TEMED 作為促凝劑,一般都是最后加入,尤其是AP(過(guò)(guò)硫酸銨)。實(shí)(shí)驗之前我們可能都會(huì )(huì )設計一個(gè)(gè)預期結果,我們可以在上一周期實(shí)(shí)驗的空余時(shí)(shí)間預備下一周所需要的實(shí)(shí)驗條件,例如重新細胞鋪板給藥等待時(shí)(shí)間周期等等。

      2、提高實(shí)(shí)驗結果的質(zhì)(zhì)量:減小系統誤差,消除人為錯誤

      以qPCR為例:該實(shí)(shí)驗檢測基因的mRNA表達水平,操作過(guò)(guò)程要求一定的準確性,因為加樣體系較小,各試劑的加樣量更要求精準,下面是一些來(lái)(lái)自個(gè)(gè)人的小tips:

      ①減小系統誤差:一般設計3個(gè)(gè)重復孔,但是后期我統計數據時(shí)(shí)發(fā)(fā)現,誤差bar仍可能較長(cháng)(cháng),這時(shí)(shí)我們可以設計4個(gè)(gè)復孔,去除一個(gè)(gè)誤差最大的值也有助于結果的準確性。這時(shí)(shí)就要求我們會(huì )(huì )更加精準的使用移液槍。另外,重復實(shí)(shí)驗也有助于提高我們加樣的準確性。

      ②制備預混液:例如我要做30(2×5×3)孔兩個(gè)(gè)基因(包含內參),5個(gè)(gè)處理,3個(gè)(gè)復孔,那么我的熒光染料一個(gè)(gè)孔需要5ul,正反引物2ul,那么我們可以再不浪費試劑的情況下,計算量可為:15.5×5+15.5×2或者(15×5+15×2)×1.1,這一定程度上都是為了消除我們人為加樣誤差。

      ③另外我們盡量增大加樣體積減少誤差:針對于10ul體系,提前將正反引物混合,配制SYBY+正反引物和cDNA+ddH2O,這時(shí)(shí)的體積為6+4或者7+3可減少加樣體積小帶來(lái)(lái)的加樣誤差。

      ④相關(guān)(guān)試劑使用前需離心使用:另外,在八聯(lián)(lián)管上機前需要用干凈的手套蓋上透明蓋子,適當離心將反應體系離心至管底。

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