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      細胞穩定轉染的操作步驟及經(jīng)(jīng)驗分享

      發(fā)(fā)布時(shí)(shí)間: 2024-06-12  點(diǎn)(diǎn)擊次數: 65次

      細胞穩定轉染是一種常用的基因傳遞技術(shù)(shù),其中慢病毒轉染作為一種有效的手段被廣泛采用。通過(guò)(guò)慢病毒載體,可將目的基因序列穩定地整合到宿主細胞基因中,實(shí)(shí)現長(cháng)(cháng)期穩定的表達。這種轉染方法不僅能夠在多種細胞系中高效地實(shí)(shí)現基因傳遞,還能夠實(shí)(shí)現對特定基因的穩定表達,為基因功能研究和細胞工程提供了重要工具。


      早在1981年,科學(xué)(xué)家們發(fā)(fā)現并研究了人類(lèi)(lèi)免疫缺陷病毒I型(HIV-1),從而掀開(kāi)(kāi)了慢病毒作為載體的研究序幕。慢病毒(Lentivirus)載體是通過(guò)(guò)HIV-1進(jìn)(jìn)行改造而得到的,其具備感染細胞的能力,包括分裂期和非分裂期細胞,同時(shí)(shí)在宿主體內能夠實(shí)(shí)現長(cháng)(cháng)期表達且具備較高的安全性。這種載體能夠穩定表達外源基因,具有廣泛的感染范圍等優(yōu)(yōu)勢,因此在基因過(guò)(guò)表達、RNA干擾、miRNA研究等實(shí)(shí)驗中得到廣泛應用。


      一、實(shí)(shí)驗步驟

      1、提前一天準備細胞

      在進(jìn)(jìn)行轉染前一天,首先對293T細胞進(jìn)(jìn)行胰酶消化處理,并將其培養于10厘米培養皿中,以確保細胞能夠充分貼壁且密度達70%-80%。隨后,將細胞置于37攝氏度、含有5% CO2的培養箱中孵育8至24小時(shí)(shí),待細胞全部貼壁后即可開(kāi)(kāi)始進(jìn)(jìn)行轉染操作。


      2、轉染

      1)轉染前,需換液,使用10毫升血清培養基替換舊的培養基。


      2)制備混合物包括包裝質(zhì)(zhì)粒和目的質(zhì)(zhì)粒與轉染試劑;

      a. 將8µg 目的質(zhì)(zhì)粒和16µg 病毒包裝質(zhì)(zhì)粒(psPAX2:pMD2.G=1:1)加入到1ml 無(wú)(wú)血清Opti-DMEM,充分混合;


      b. 將50µl轉染試劑溶于1ml Opti-DMEM中,充分混合,靜置5分鐘;


      c. 將轉染試劑稀釋液滴加入質(zhì)(zhì)粒稀釋液中,邊滴加邊輕輕混合,然后在室溫下靜置20分鐘,使DNA和轉染試劑充分結合形成穩定的轉染復合物。取出培養皿,將配制好的DNA-轉染試劑混合物加入培養皿中,輕輕混合,標記后放回培養箱中;


      3)經(jīng)(jīng)過(guò)(guò)6~8小時(shí)(shí)后,吸除培養基,用4ml PBS清洗一次,然后加入8ml 新鮮血清培養基進(jìn)(jìn)行培養。


      3、收病毒

      進(jìn)(jìn)行轉染后,每隔24小時(shí)(shí)將培養上清收集至50毫升離心管中,進(jìn)(jìn)行適當標記,并為細胞更換新鮮的血清培養基。在最后一次收集病毒液后,應將接觸過(guò)(guò)病毒的槍頭、離心管、培養皿等物品浸泡于84消毒液中進(jìn)(jìn)行消毒處理,然后安全丟棄。

      細胞穩定轉染的操作步驟及經(jīng)(jīng)驗分享

      4、包裝病毒

      貼壁細胞:

      1)慢病毒轉染前一天,將貼壁細胞鋪到24孔板中,確保每孔約有2×10^5個(gè)(gè)細胞。第二天,在37攝氏度下使用含有6 μg/ml polybrene的2毫升新鮮培養基替換原有培養基,并加入適量病毒懸液孵育。

      2)對于polybrene毒性敏感的細胞,在轉染后4小時(shí)(shí)內加入2毫升新鮮培養基以稀釋polybrene。

      3)繼續培養24小時(shí)(shí),然后用新鮮培養基替換含病毒的培養基。

      4)繼續傳代培養,如果慢病毒含有熒光蛋白,在轉染后48小時(shí)(shí)通??捎^(guān)(guān)察到明顯的熒光表達,72小時(shí)(shí)后表達更為明顯,如果慢病毒含有抗性基因并需要進(jìn)(jìn)行藥物篩選,則可在轉染3-4天后開(kāi)(kāi)始添加藥物。

      懸浮細胞:

      1)將濃度為6 μg/ml 的polybrene加入2×10^5/ml懸浮細胞中,并加入適量病毒,充分混勻后在37攝氏度下孵育?;蛘哌M(jìn)(jìn)行室溫離心,離心速度為150g,持續4小時(shí)(shí)(對于難以轉染的細胞系,可選擇此步驟以提高轉染效率)。

      2)對于對polybrene毒性敏感的細胞,轉染后4小時(shí)(shí),加入相同體積的新鮮培養基以稀釋polybrene。

      3)繼續培養3-4天。根據細胞生長(cháng)(cháng)情況,可以進(jìn)(jìn)行細胞傳代或者更換培養基

      二、注意事項

      1)進(jìn)(jìn)行慢病毒相關(guān)(guān)實(shí)(shí)驗時(shí)(shí)要注意安全,穿實(shí)(shí)驗服,戴口罩和手套。

      2)在操作病毒時(shí)(shí)務(wù)(wù)必小心,避免產(chǎn)(chǎn)生氣霧或飛濺,所有接觸過(guò)(guò)病毒的工具,如槍頭、離心管、培養皿以及培養液,請浸泡在84消毒液中過(guò)(guò)夜后,確保全部消毒后再進(jìn)(jìn)行處理。

      3)病毒操作時(shí)(shí)要使用生物安全柜,如果使用普通超凈工作臺,不能打開(kāi)(kāi)風(fēng)(fēng)機。

      4)如果加入Puromycin后觀(guān)(guān)察到細胞死亡較多,務(wù)(wù)必及時(shí)(shí)更換培養基,以防止死細胞釋放的有害物質(zhì)(zhì)影響到具有抗性的細胞的生長(cháng)(cháng)。

      5)需注意病毒液的儲存方式:若在短時(shí)(shí)間內(3天內)需要使用,可將病毒液存放于4攝氏度的冰箱中。然而,若無(wú)(wú)法在短期內全部使用,建議將慢病毒液分裝后置于-80攝氏度的冰箱中保存。在分裝時(shí)(shí)應根據每次使用的量進(jìn)(jìn)行,將準確的病毒液分裝至凍存管中,并做好日期和儲存量的標記,封口膜密封以確保密封性。病毒液在-80攝氏度的冰箱中可保存約6個(gè)(gè)月。

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